董哲，孙玲，陈志恒，简悦红（广州市妇女儿童医疗中心生殖医学中心，广州 510623）【摘要】目的 比较给予排卵监测的方案（MOR）与基于孕酮水平监测的方案（MPR）确定自然周期冻融胚胎移植（FET）时机的临床结局。方法 回顾性分析190个自然周期FET的临床资料。结果 61.1%（116/190）的周期应用MPR、MOR组的临床妊娠率相似，分别为53.4%及51.4%，种植率、持续妊娠率及活产率的差异亦无统计学意义（P＞0.05）。多元Logistic回归分析显示移植方案是生化妊娠的独立影响因素，MPR与升华妊娠呈负相关【（OR0.050，95% CI 0.004,0.593）】（P=0.018）。结论 在基本情况及周期治疗情况相似的患者中，与MOR方案相比，MPR方案进行自然周期FET可能获得更低的生化妊娠率（即更低的妊娠丢失率），但仍需进一步研究证实。【关键词】 冻融胚胎移植，自然周期，方案，孕酮在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的治疗中，一般认为冻融胚胎移植（FET）的妊娠率低于新鲜胚胎移植。然而，FET也有其优势，比如增加累计妊娠率、减少花费、便于应用及同新鲜周期比较有更短的治疗周期等特点。生殖医学工作者为了改善FET的结局开展了大量的工作，其中包括对冷冻技术的改进如玻璃化冷冻技术。玻璃化冷冻是一种使用高浓度冷冻剂进行快速冷冻程序的技术，有助于避免冰晶的形成。玻璃化冷冻的胚胎复苏率可达到95%以上，并可减少细胞损伤，使胚胎保持与新鲜胚胎相似的生殖潜能。FET的成功与两方面因素密切相关，即胚胎质量与胚胎子宫内膜间的同步化。尽管冷冻技术的改进极大地提高了FET的妊娠率，但是对如何改善胚胎及子宫内膜的同步化仍知之甚少。目前，世界范围内用于FET周期内膜准备的方案主要有三种：自然周期、促排卵周期及人工周期。无足够证据表明哪种方案更为优越，它们的妊娠率无明显差异。国内研究也证实，自然周期与人工周期的妊娠率、种植率间的差异亦无显著性。然而，无药物应用等特点仍使自然周期得到更为广泛的应用。在自然周期方案中，内膜情况及FET时间通常由排卵时间决定。众所周知，内膜的转化程度是由孕酮（P）的浓度和作用时间决定的，P水平才是决定内膜容受性的关键因素。因此，是否能够通过直接检测自然周期P水平决定FET时间呢？我们提出了一个新的基于P水平决定自然周期方案FET时间的方法，在本研究中，我们将其临床结局与监测排卵法自然周期FET进行对比，以评价其临床效果。材料与方法一、研究对象本研究选取2011年3月至2012年7月在本院生殖医学中心进行自然周期FET治疗的妇女为观察对象，所有妇女在治疗前均签署了知情同意书。入选标准包括：（1）年龄：25-40岁；（2）月经规律（周期25-34d）；（3）体外受精治疗周期有D3胚胎冻存；（4）第一次冻融胚胎移植；（5）子宫腔未发现异常；（6）签署知情同意书。排除标准：使用睾丸或附睾精子进行体外授精，早卵泡期卵泡刺激素（FSH）≥12U/L，移植日内膜厚度＜8mm及体重指数（BMI）≥30kg/m²。二、自然周期内膜准备方案入选观察对象根据治疗方案的不同分为两组，具体治疗方案如下：1.排卵为基础的自然周期方案（MOR）：从月经第8-10日起开始应用B超监测卵泡发育，主导卵泡直径≥14mm后每日用黄体生成素（LH）试纸（上海凯创生物技术）监测尿LH。LH试验呈阳性第2日如果主导卵泡消失，则认定为排卵日（即D0），FET于D3进行。移植日开始给予地屈孕酮片（雅培，荷兰）10mgq8h口服。2.孕酮（P）水平为基础的自然周期方案（MPR）：从月经第10日起，每4日一次监测卵泡发育，此方案不需确定排卵的具体日期。一旦发现主导卵泡消失，当日即检测血清P水平。排卵及移植时间定义如下：P≤9.54nmol/L为排卵日（D0）；9.54nmol/L＜P≤19.08nmol/L为D1;19.08nmol/L＜P≤25.44nmol/L为D2；25.44nmol＜P≤31.8nmol/L为D3，FET于D3进行。P≥31.8nmol/L为超过排卵后第3日，取消移植。移植日开始给予地屈孕酮片10mgq8h口服。三、FET时机及结局评价指标FET治疗周期后所有观察对象均有D3胚胎冻存。胚胎均为玻璃化冷冻并按说明书标准流程复苏，采用Jieying thawing 培养基（Jieying Laboratory Inc，加拿大）。胚胎移植均选用标准胚胎移植管（Wallace,Smith Medical，墨西哥），在腹部B超引导下进行。根据年龄、既往进行的移植周期数及患者意愿等因素，本研究中移植的胚胎数目为2或3个。优质胚胎定义为D3胚胎有7或8个大小均匀、形状相似的卵裂球，碎片＜10%，无多核。研究中主要由三名医师进行胚胎移植。妊娠定义为移植后14d的血清β-HCG检测为阳性；临床妊娠定义为移植后4周阴道B超检查可见妊娠囊；生化妊娠定义为移植后14d的血清β-HCG检测为阳性，移植后4周及以后B超检查未见妊娠囊；种植率为孕囊数/移植胚胎数；持续妊娠为妊娠持续至≥12周。四、统计学分析本研究主要应用SPSS13.0软件（SPSS Inc，美国）进行统计学分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验对连续变量进行正态分布检验。连续变量采用均值±标准差描述。根据正态分布情况，连续变量间的差异由t检验或Mann-Whitney检验确定。分类变量间的差异由Pearson’s x²检验确定。多元因素Logistic回归分析用来确定FET方案与生化妊娠间的相关因素，使用Wald x²检验对回归模型进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结 果共190个观察对象（190个一直周期）纳入本研究。MOR组74例（38.9%），MPR组116例（61.1%）。一、MOR组和MPR组临床基本情况的比较两组病例在年龄、BMI、基础FSH及不育因素间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（表1）。二、MOR组和MPR组IVF周期及FET周期的治疗情况两组的促性腺激素（Gn）用量、HCG日雌二醇（E2）水平、卵胞浆内单精子注射（ICSI）周期的比例、受精率、冷冻胚胎数、复苏胚胎数、移植胚胎数、移植优质胚胎数及移植日内膜厚度等指标均无显著性差异（P＞0.05），两组辅助孵化的使用率均为100%（表2）。三、MOR组及MRP组FET周期的临床结局两组间的临床妊娠率、持续妊娠率及种植率均无显著性差异（P＞0.05），但MPR组的生化妊娠率显著低于MOR组（1.7% vs. 9.5%，P＜0.05）（表3）。四、生化妊娠的多元因素Logistic回归分析为了进一步确定FET方案与生化妊娠之间的相关因素，使用了多元因素Logistic回归分析。校正混杂因素后，MPR显示出了与生化妊娠间的负相关关系，比值比（OR）为0.050,95%CI为0.004-0.593（P=0.018）。此外，BMI显示出了与生化妊娠间的正相关关系（P=0.031）（表4）。表1 两组基本情况的比较表【file:///C:/Users/l/AppData/Local/Temp/ksohtml/wpsC34C.tmp.jpg±s，n（%）】            [tr]            [td=1,2,56]            组别            [/td]            [td=1,2,56]            例数            [/td]            [td=1,2,56]            年龄（岁）            [/td]            [td=1,2,56]            BMI（Kg/mp²）            [/td]            [td=1,2,56]            基础FSH（U/L）            [/td]            [td=5,1,284]            不育因素            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,56]            输卵管因素            [/td]            [td=1,1,56]            男方因素            [/td]            [td=1,1,56]            内异症            [/td]            [td=1,1,56]            双方因素            [/td]            [td=1,1,56]            不明原因            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,56]            MOR组            [/td]            [td=1,1,56]            74            [/td]            [td=1,1,56]            31.92±0.52            [/td]            [td=1,1,56]            20.84±0.26            [/td]            [td=1,1,56]            5.31±0.15            [/td]            [td=1,1,56]            47（63.5）            [/td]            [td=1,1,56]            15（20.3）            [/td]            [td=1,1,56]            8（10.8）            [/td]            [td=1,1,56]            3（4.1）            [/td]            [td=1,1,56]            1（1.3）            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,56]            MPR组            [/td]            [td=1,1,56]            116            [/td]            [td=1,1,56]            32.29±0.40            [/td]            [td=1,1,56]            21.04±0.28            [/td]            [td=1,1,56]            5.42±0.11            [/td]            [td=1,1,56]            64（55.2）            [/td]            [td=1,1,56]            37（31.8）            [/td]            [td=1,1,56]            11（9.5）            [/td]            [td=1,1,56]            4（3.5）            [/td]            [td=1,1,56]            0            [/td]        [/tr]   

注：两组比较，P均＞0.05.表2两组的体外受精治疗周期情况的比较【file:///C:/Users/l/AppData/Local/Temp/ksohtml/wpsC36C.tmp.jpg±s，n（%）】            [tr]            [td=1,1,71]            组别            [/td]            [td=1,1,71]            例数            [/td]            [td=1,1,71]            Gn总量（U）            [/td]            [td=1,1,71]            HCG日E2水平（pmol/L）            [/td]            [td=1,1,71]            ICSI            [/td]            [td=1,1,71]            辅助孵化            [/td]            [td=1,1,71]            受精率            [/td]            [td=1,1,71]            冷冻胚胎数            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,71]            MOR组            [/td]            [td=1,1,71]            74            [/td]            [td=1,1,71]            1945.95±96.84            [/td]            [td=1,1,71]            11525.10±717.83            [/td]            [td=1,1,71]            16（21.6）            [/td]            [td=1,1,71]            74（100.0）            [/td]            [td=1,1,71]            0.67±0.02            [/td]            [td=1,1,71]            7.43±0.56            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,71]            MPR组            [/td]            [td=1,1,71]            116            [/td]            [td=1,1,71]            2066.41±80.30            [/td]            [td=1,1,71]            9817.23±453.54            [/td]            [td=1,1,71]            29（25.0）            [/td]            [td=1,1,71]            116（100.0）            [/td]            [td=1,1,71]            0.72±0.01            [/td]            [td=1,1,71]            6.90±0.44            [/td]        [/tr]   

            [tr]            [td=1,1,81]            组别            [/td]            [td=1,1,81]            例数            [/td]            [td=1,1,81]            复苏胚胎数            [/td]            [td=1,1,81]            复苏率            [/td]            [td=1,1,81]            移植胚胎数            [/td]            [td=1,1,81]            移植优质胚胎数            [/td]            [td=1,1,81]            移植日内膜厚度（mm）            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,81]            MOR组            [/td]            [td=1,1,81]            74            [/td]            [td=1,1,81]            2.36±0.08            [/td]            [td=1,1,81]            0.97±0.01            [/td]            [td=1,1,81]            2.27±0.07            [/td]            [td=1,1,81]            0.97±0.11            [/td]            [td=1,1,81]            10.58±0.14            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,81]            MPR组            [/td]            [td=1,1,81]            116            [/td]            [td=1,1,81]            2.27±0.06            [/td]            [td=1,1,81]            0.97±0.01            [/td]            [td=1,1,81]            2.09±0.05            [/td]            [td=1,1,81]            0.85±0.08            [/td]            [td=1,1,81]            10.76±0.21            [/td]        [/tr]   

注：与MOR组比较，P＜0.05。表3 两组的FET治疗周期临床结局的比较【n(%)】            [tr]            [td=1,1,71]            组别            [/td]            [td=1,1,71]            例数            [/td]            [td=1,1,71]            临床妊娠率            [/td]            [td=1,1,71]            生化妊娠率            [/td]            [td=1,1,71]            异位妊娠率            [/td]            [td=1,1,71]            种植率            [/td]            [td=1,1,71]            持续妊娠率            [/td]            [td=1,1,71]            活产率            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,71]            MOR组            [/td]            [td=1,1,71]            74            [/td]            [td=1,1,71]            38（51.4）            [/td]            [td=1,1,71]            7（9.5）            [/td]            [td=1,1,71]            2（2.7）            [/td]            [td=1,1,71]            55/168（32.7）            [/td]            [td=1,1,71]            32（43.2）            [/td]            [td=1,1,71]            29（39.1）            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,71]            MPR组            [/td]            [td=1,1,71]            116            [/td]            [td=1,1,71]            62（53.4）            [/td]            [td=1,1,71]            2（1.7）            [/td]            [td=1,1,71]            6（5.2）            [/td]            [td=1,1,71]            75/239（31.3）            [/td]            [td=1,1,71]            49（42.2）            [/td]            [td=1,1,71]            45（38.8）            [/td]        [/tr]   

注：MOR组比较，P＜0.05。表4 生化妊娠的多元因素Logistic回归分析            [tr]            [td=1,1,142]            相关因素            [/td]            [td=1,1,142]            OR            [/td]            [td=1,1,142]            95%CI            [/td]            [td=1,1,142]            P            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            年龄            [/td]            [td=1,1,142]            0.875            [/td]            [td=1,1,142]            0.730-1.047            [/td]            [td=1,1,142]            ＞0.05            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            BMI            [/td]            [td=1,1,142]            1.307            [/td]            [td=1,1,142]            1.024-1.669            [/td]            [td=1,1,142]            0.031            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            移植胚胎数            [/td]            [td=1,1,142]            0.616            [/td]            [td=1,1,142]            0.133-2.859            [/td]            [td=1,1,142]            ＞0.05            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            移植优质胚胎数            [/td]            [td=1,1,142]            1.384            [/td]            [td=1,1,142]            0.615-3.114            [/td]            [td=1,1,142]            ＞0.05            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            移植日内膜厚度            [/td]            [td=1,1,142]            0.769            [/td]            [td=1,1,142]            0.411-1.438            [/td]            [td=1,1,142]            ＞0.05            [/td]        [/tr]        [tr]            [td=1,1,142]            治疗方案（MPR）            [/td]            [td=1,1,142]            0.050            [/td]            [td=1,1,142]            0.004-0.593            [/td]            [td=1,1,142]            0.018            [/td]        [/tr]   

讨 论在FET方案中，自然周期的应用十分广泛。因P的浓度及作用在内膜的转化及种植前准备中发挥了最为关键的作用，故我们提出了这种通过检测排卵后血清P水平确定FET时机的方法。这种方法的关键是如何确定P的界值。通过文献得知，自然周期中，排卵日的P升高并不显著，D1的P水平也在9.54nmol/L以下；随后，P水平逐渐升高，D2的P水平在9.54-19.08nmol/L；D3的P水平约19.08-25.44nmol/L；D4的P水平升至25.44-31.8nmol/L。本研究连续监测月经周期正常的志愿者的血清P水平，也得到了相似的结果。在MPR方案中，我们设定P≤9.54nmol/L为排卵日（D0），9.54nmol/L＜P≤19.08nmol/L为D1，19.08nmol/L＜P≤25.44nmol/L为D2，25.44nmol/L＜P≤31.8nmol/L为D3。这样使胚胎移植的日期实际上晚于真正的D31d，即晚于MOR法1d。我们如此设定的原因是什么？因为自然妊娠情况下，8细胞胚胎进入子宫腔的时间是D4或D5，而不是D3。这说明8细胞胚胎与D4或D5的内膜是同步的。人工周期的研究也显示，P应用4-5d后移植4-8细胞胚胎所获妊娠率最高，进一步佐证了这个结论。在MOR方案中，我们其实推定排卵后受精立即发生，胚胎发育与排卵后内膜发育完全同步，然而以上事实白哦名，在自然周期中，D3的内膜并不适宜D3胚胎种植，排卵后第3天移植D3胚胎可能过早。也是基于这个原因，我们按上面方法设定P值，使MPR方案更接近于自然妊娠的过程。为了证实MPR方法的有效性，我们将MPR治疗患者的结局与MOR组进行比较。本研究结果提示，在基本情况及周期治疗情况具有可比性的患者中，MPR治疗可以获得与MOR相似的临床结局。两组的临床妊娠率、持续妊娠率及种植率无显著性差异。表明MPR在确定FET时机方面具有与传统MOR法相似的效果。事实上，两种治疗方法确定的移植时间并不完全一致，但是相似的结局可能提示内膜的容受性是一段时间而不是特定的时间点。既往的研究也发现胚胎的种植窗从P作用的48h以后开始，并可能持续4d。尽管没有证据支持MPR方案由于MOR方案，但是MOR组有着更高的生化妊娠率。多元因素回归分析也显示MPR是降低生化妊娠的独立因素。MPR可能有助于降低生化妊娠率。通常认为只有生化妊娠（而无临床妊娠）意味着胚胎着床的失败，由于两种治疗方法确定的移植时间并不完全一致，使移植时内膜的转化程度也不尽相同，这可能导致了子宫内膜的容受性及胚胎着床结局的差异，即两组生化妊娠率的差异可能是由移植方案确定的移植时机不同引起的。BMI是另外一个影响生化妊娠率的因素，虽然具体原因仍不清楚，但是已有研究发现过高或过低的BMI均与FET后流产相关。虽然我们未能证实MPR在治疗结局上的优越性，但是与MOR相似的妊娠率及以下优点使其更具应用价值：首先，MPR可能发现一些潜在的黄体功能不全患者。在治疗中我们发现个别患者在B超确定排卵后P不出现升高，隔日再次检测P水平上升仍不明显，甚至无上升。这种现象可能是黄体功能不全的一种表现，而MPR可以筛选出这类患者，并于下个周期可采用人工周期FET，避免移植后的不良结局。其次，即使发生未破裂卵泡黄素化，MPR仍可决定移植时机。通常发生未破裂卵泡黄素化时，MOR很难确认排卵时机，从而增加了FET的周期取消率，而只要P水平达到设定值，MPR仍能通过P水平确定移植时机。最后MPR方法方便了患者。患者不再需要频繁来到医院密切监测卵泡生长，只要确定有优势卵泡发育且排卵即可通过一次血清监测确定移植时机。越来越多的研究表明，新鲜周期的分泌前期内膜处于亢进的状态，并不适合胚胎的种植。同Gn刺激下的新鲜周期内膜相比，FET周期的内膜更易于控制，因此FET周期中胚胎及内膜发育的同步化将更有利于妊娠。不同于以往的认识，近期的随机对照研究同样证实，FET周期的妊娠率显著高于新鲜周期移植，且FET可能有助于改善持续妊娠率及IVF治疗的结局。这些事实都提示，FET可能是进一步提高IVF治疗效果的有效手段，而我们的研究旨在寻找更合适的FET时机，并为提高FET临床结局提供新的思路。在自然周期FET的患者中，通过使用MPR可以获得与MOR相似的临床妊娠率及持续妊娠率，但MPR可能有助于降低只有生化妊娠（而无临床妊娠），即降低妊娠丢失率。目前，我们的研究暂无充分证据表明MPR与MOR的优劣性，故仍需要扩大样本量得出进一步结论。然而，MPR在应用中也显示了自身的一些优点，本结果为进一步开展P为基础的自然周期FET方案提供了依据。